Abstract
Eukaryotisk Topoisomerase 1 (Top1) opløser DNA-vridninger, som bygges op foran replikationsgaflen, og dermed sikrer fremdrift af replikationsgaflen. I dens enzymatiske reaktion kløver Top1 et af DNA-strengene og bliver herved koblet kovalent til 3’ enden i et Top1-kløvningskompleks. Hermed kan topologiske over- eller undervridninger af DNA’et opløses før enzymet faciliterer religering af enderne. Hvis enderne ikke flugter, så vil Top1-kløvningskomplekset blive stabiliseret, og dette vil udgøre en risiko for DNA replikationen. Mislykket Top1 aktivitet er ikke en sjældenhed for cellen, og udgør derfor en endogen udfordring for genom-integriteten.
Denne afhandling undersøger Top1-associeret skade under replikationen forårsaget af mislykket Top1 aktivitet. Her er skaden undersøgt fra to forskellige perspektiver. Det globale perspektiv tager udgangspunkt i Top1 ligeringsmutanten (Top1(T722A)), som udviser reduceret religeringsaktivitet, men opløser DNA over- eller undervridninger i næsten samme grad som vildtype Top1 gør. Den lokale fremgangsmåde benytter Flp-nick systemet, som genererer en Top1-efterlignende skade et bestemt sted i gær-genomet. Ved brug af begge systemer finder vi ud af, at Top1-associeret skade under DNA replikationen bliver opdaget af checkpoint sanse-kinasen Mec1, og at den anden checkpoint sanse-kinase Tel1 spiller en beskyttende rolle med hensyn til replikationsafløb ved skaden. Desuden så er Tel1 vigtig for effektiv resektion af det DNA-strengebrud, som opstår ved replikationsafløb, og som derfor kun har en ende. Undersøgelser i fremtiden vil udforske, hvordan Tel1 beskytter mod replikationsafløb ved en Top1-skade. For at udvide undersøgelserne af de stedspecifikke Top1-skader til højere eukaryoter, oversættes Flp-nick systemet i gær til et HEK293T cellelinje Flp-nick system ved hjælp af CRISPR/Cas9-medieret integrering af Flp genkendelses-sekvensen (FRT) samt transient udtryk af Flp ligeringsmutanten. Det humane Flp-nick system afslører at HEK293T celler udviser et højt niveau af DNA-strengebrud ved Flp-nick skaden. Ved hjælp af dette nye system vil fremtidig forskning indenfor Top1-associeret skade i humane celler bidrage til viden indenfor Top1-associeret endogen skade i mennesker samt de molekylære detaljer for S-fase specifik brud-induceret replikation i humane celler. Denne afhandlinger indeholder ydermere udviklingen af en global fremgangsmåde, der identificerer proteiner, som interagerer med Top1-associeret skade i S-fasen. Her akkumuleres Top1-associeret skader ved brug af Top1 ligeringsmutanten i gærceller. Skaderne isoleres med kromatin-optimeret affinitets-oprensning, og de proteiner, som interagerer med Top1-associeret skade, identificeres og kvantificeres med massespektrometri. Denne fremgangsmåde resulterer i et bibliotek af interaktioner, hvoraf udvalgte interaktioner vil blive verificeret i fremtiden og undersøgt videre med Flp-nick systemet.
De globale og lokale undersøgelser af cellulære reaktioner på mislykket Top1 aktivitet under DNA replikationen i enten gær eller humane celler giver alt i alt et robust fundament for fortsat forskning indenfor området, som vil udvide den viden, der er indenfor Top1-associeret endogen skade.
Denne afhandling undersøger Top1-associeret skade under replikationen forårsaget af mislykket Top1 aktivitet. Her er skaden undersøgt fra to forskellige perspektiver. Det globale perspektiv tager udgangspunkt i Top1 ligeringsmutanten (Top1(T722A)), som udviser reduceret religeringsaktivitet, men opløser DNA over- eller undervridninger i næsten samme grad som vildtype Top1 gør. Den lokale fremgangsmåde benytter Flp-nick systemet, som genererer en Top1-efterlignende skade et bestemt sted i gær-genomet. Ved brug af begge systemer finder vi ud af, at Top1-associeret skade under DNA replikationen bliver opdaget af checkpoint sanse-kinasen Mec1, og at den anden checkpoint sanse-kinase Tel1 spiller en beskyttende rolle med hensyn til replikationsafløb ved skaden. Desuden så er Tel1 vigtig for effektiv resektion af det DNA-strengebrud, som opstår ved replikationsafløb, og som derfor kun har en ende. Undersøgelser i fremtiden vil udforske, hvordan Tel1 beskytter mod replikationsafløb ved en Top1-skade. For at udvide undersøgelserne af de stedspecifikke Top1-skader til højere eukaryoter, oversættes Flp-nick systemet i gær til et HEK293T cellelinje Flp-nick system ved hjælp af CRISPR/Cas9-medieret integrering af Flp genkendelses-sekvensen (FRT) samt transient udtryk af Flp ligeringsmutanten. Det humane Flp-nick system afslører at HEK293T celler udviser et højt niveau af DNA-strengebrud ved Flp-nick skaden. Ved hjælp af dette nye system vil fremtidig forskning indenfor Top1-associeret skade i humane celler bidrage til viden indenfor Top1-associeret endogen skade i mennesker samt de molekylære detaljer for S-fase specifik brud-induceret replikation i humane celler. Denne afhandlinger indeholder ydermere udviklingen af en global fremgangsmåde, der identificerer proteiner, som interagerer med Top1-associeret skade i S-fasen. Her akkumuleres Top1-associeret skader ved brug af Top1 ligeringsmutanten i gærceller. Skaderne isoleres med kromatin-optimeret affinitets-oprensning, og de proteiner, som interagerer med Top1-associeret skade, identificeres og kvantificeres med massespektrometri. Denne fremgangsmåde resulterer i et bibliotek af interaktioner, hvoraf udvalgte interaktioner vil blive verificeret i fremtiden og undersøgt videre med Flp-nick systemet.
De globale og lokale undersøgelser af cellulære reaktioner på mislykket Top1 aktivitet under DNA replikationen i enten gær eller humane celler giver alt i alt et robust fundament for fortsat forskning indenfor området, som vil udvide den viden, der er indenfor Top1-associeret endogen skade.
| Translated title of the contribution | Mislykket Topoisomerase I aktivitet under replikationen: Globale og lokale undesøgelser |
|---|---|
| Original language | English |
| Publisher | Århus Universitet |
|---|---|
| Number of pages | 137 |
| Publication status | Published - Mar 2022 |