Definition og beskrivelse af referencetilstanden er centralt for implementering af vandrammedirektivet, da bedømmelse af den økologiske tilstand sker som afvigelsen fra den upåvirkede referencetilstand. I denne rapport præsenteres analyser af danske, udenlandske og historiske data med det formål at definere og beskrive referencetilstanden for fisk, makroinvertebrater og makrofyter i vandløb. Med udgangspunkt i NOVANA-data er der foretaget en screening af danske vandløb for referencestatus. Fysiske, kemiske, hydromorfologiske og påvirkningsmæssige kriterier fastsat ud fra REFCOND-anbefalinger blev anvendt i en screening af 128 a priori-udvalgte referencevandløb. Kun 3 af disse opfylder de lempede referencekrav og kan betegnes som værende i lempet referencetilstand. Den væsentligste årsag til manglende opfyldelse af kravene er andelen af landbrug og befæstet areal i oplandet. En screening af samtlige danske vandløb blev derfor foretaget med disse 2 kriterier, men kun få og fortrinsvist meget små vandløb opfylder kriterierne. Det kan derfor konkluderes, at der inden for Danmarks grænser ikke findes tilstrækkeligt med referencevandløb til, at den naturlige variation i de biologiske kvalitetselementer kan beskrives. En analyse og sammenligning af makrofytsamfund i Danmark og Baltikum samt efterfølgende validering med historiske data fra danske vandløb viste stor lighed mellem nutidige plantesamfund i Baltikum og historiske samfund i Danmark. Det er derfor muligt at bruge Baltiske vandløb som referencer for danske vandløb mht. makrofyter. Der kræves yderligere undersøgelser, før det kan afgøres om vandløb i Baltikum kan fungere som referencer for danske vandløb mht. fisk og makroinvertebrater. Rapporten indeholder anbefalinger til fremtidigt arbejde med beskrivelse af referencetilstanden.