DNA Nanotechnology as a platform for drug delivery

Publikation: Bog/antologi/afhandling/rapportPh.d.-afhandlingForskning

Denne ph.d.-afhandling beskriver metoder og strategier til syntese af funktionelle DNA-nanostrukturer designet med terapeutisk øjemed.

Afhandlingen præsenterer først en metode til enzymatisk funktionalisering af nativt DNA og efterfølgende brug til produktion af funktionelle strukturer. Metoden demonstreres først med funktionelle grupper, som påsættes 3' hydroxyl gruppen af DNA oligonukleotider. Derefter videreudvikles metoden og det vises at reaktionen kan bruges til at ligere store biomolekyler til DNA. Brug af den enzymatiske reaktion giver fuldt udbytte, selv ved lave koncentrationer, og kræver ingen forudgående optimering.

Derefter beskrives strategier til syntese af poly(ethylen glykol) konjugerede ("PEGylerede") oligodeoxynukleotider, både via enzymatisk ligering og med traditionel NHS-konjugering. Optimale betingelser til konjugering af amino-funktionaliseret DNA til polymerer 5--20 kDa i størrelse i vandig opløsning bliver præsenteret og derefter sammenlignet med den langt mere effektive rute baseret på enzymatisk ligering.

Dernæst præsenteres metoder til at oprense PEGylerede oligodeoxynukleotider. Et vigtigt kriterium er hvorvidt metoderne kan anvendes til at oprense mange oligonukleotider med forskellig længde på én gang. Dette gør det betydeligt lettere at funktionalisere DNA origami strukturer, men specielt på dette punkt klarer traditionelle metoder sig meget dårligt. Nye teknikker baseret på gel elektroforese eller to-fase ekstrahering bliver udviklet og sammenlignet. Især en metode baseret på et vandigt polymer-salt to-fase system viser sig at være egnet til at oprense PEGylaterede oligodeoxynukleotider med forskellig længde.

De PEGylerede og oprensede oligodeoxynukleotider bliver derefter brugt til at samle DNA origami strukturer. Både enkelt-lags og mange-lags strukturer bliver samlet og karakteriseret, og især for solide strukturer med mange lag viser det sig vigtigt at både design og selv-samlingsproces er optimeret. Afsnittet indeholder også studier af indflydelsen af PEGylering på stabiliteten af DNA origami strukturerer i serum, og rapporterer nyudviklede metoder til at isolere og kvantificere PEGylerede origami strukturer fra serum og blod.

Næste del af afhandlingen præsenterer tre separate projekter, hvor DNA origami strukturer anvendes til drug delivery. Det første projekt bruger proteinet Transferrin som targeting ligand til at øge optaget i KB celler. Ved at fastgøre Transferrin til origami strukturer øges optaget af disse med op til 74 fold.


I det næste projekt bruges folsyre som targeting ligand. Folsyre-gruppen påsættes PEG polymerer, og bruges til at lave PEGylerede DNA origami strukturer med folsyre på ydersiden. Projektet præsenterer syntese og oprensning af PEG-folsyre og DNA-PEG-folsyre produkter, samt selvsamling af folsyre-PEGylerede DNA origami strukturer. Hidtidige in vitro forsøg har dog ikke kunne påvise et øget optaget i KB celler.

Endelig bliver origami strukturer brugt til at levere siRNA til KB celler. Omend det vises at påhæftning af små internt segmenterede interfererende RNA molekyler (sisiRNA) på origami strukturer ved efterfølgende transfektering reducerer udtrykket af det tilsigtede gen, så påviser studierne også en stor indflydelse fra uspecifik reduktion forårsaget af DNA origami strukturerne.
Endeligt laves strukturer med både Transferrin og siRNA. Disse strukturer giver dog ikke nedsat udtryk af rapporter-genet, formodentligt på grund af manglende evne til at undslippe endosomal indkapsling.


I den sidste del af afhandlingen præsenteres en række mindre projekter. Det første projekt viser, at det er muligt at samle DNA strukturer under ikke-denaturerende betingelser ved langsomt at varierer magnesium koncentrationen fra 0 til 13 mM. Dette går det muligt at undgå høje temperaturer eller kemiske solventer, som normalt bruges til at samle origami strukturer, hvilket kan være af stor nytte hvis enzymer og andre proteiner skal inkorporeres i origami strukturer.

Det næste projekt bruger ATP til enzymatisk funktionalisering af oligodeoxynukleotider. Prisen på kommercielt tilgængelige funktionelle triphosphater er pt meget høj og et signifikant argument mod at bruge den ellers effektive enzymatiske metode til at funktionalisere DNA. ATP er dog mange størrelsesordner billigere end traditionelle triphosphater, og i projektet vises det hvordan ATP-baseret funktionalisering kan bruges til syntese af fx en biotin-funktionaliseret oligonukleotid. Det sidste projekt er et studie af en tidligere publiceret DNA-box origami, hvor især boksens låg karakteriseres med ensemble og enkelt-molekyle FRET.

Afhandlingen indledes med en introduktion til DNA Nanoteknologi, inklusiv et afsnit dedikeret til terapeutisk anvendelse af DNA strukturer og baggrund og tidligere arbejde fra drug delivery feltet præsenteres kort.
OriginalsprogEngelsk
ForlagAarhus University, Faculty of Science and Technology
Antal sider140
Rekvirerende organGraduate School of Science and Technology
StatusUdgivet - 12 nov. 2013

    Forskningsområder

  • DNA Nanoteknologi, Drug delivery, PEGylering

Se relationer på Aarhus Universitet Citationsformater

ID: 55444445