Institut for Biomedicin

Christian Bjerggaard Vægter

The Human Dopamine Transporter: Investigating the Role of the C Terminus in Surface Targeting

Publikation: Bog/antologi/afhandling/rapportPh.d.-afhandlingForskning

  • Institut for Medicinsk Biokemi

Dopaminerg neurotransmission har indflydelse på moduleringen af

motorikken, følelsesmæssig adfærd, hukommelse og bevidsthed.

Derfor formodes det, at ubalancer i det dopaminerge system bidrager

til sygdomsudviklingen i adskillige lidelser, deriblandt Parkinson's

sygdom, skizofreni, ADHD ("Attention Deficit Hyperactivity Disorder")

og stofafhængighed.

Dopamintransporteren (DAT) er et præsynaptisk protein i

dopaminerge nervecelle-terminaler, som afslutter dopaminerg

signalering ved hurtigt at genoptage frigivet dopamin fra synapsekløften.

DAT spiller derfor en vigtig rolle i vedligeholdelsen af den

korrekte dopaminerge tonus på postsynaptiske membraner og som

mål for både farmaceutiske og narkotiske stoffer. Trods denne

betydning vides der meget lidt om reguleringen af transportaktiviteten

og overfladetilgængeligheden af DAT i levende neuroner.

DAT indeholder et C terminalt PDZ-domænebindende motiv (med

sekvensen LKV), som vides at interagere med PDZ-domæneproteiner

så som PICK1 ("Protein Interacting with C-Kinase 1"). I overensstemmelse

med andre rapporter har vi fundet, at ved at slette dette

motiv bliver DAT tilbageholdt i det endoplasmatiske reticulum (ER) i

HEK293 og Neuro2A celler. Dette antyder, at PDZ-domæneinteraktioner

spiller en kritisk rolle i DAT-targeting. Vi har dog været i

stand til at konstruere mutationer i DAT C terminalen, som var ude af

stand til at binde PICK1, men som stadig blev udtrykt på plasmamembranen.

Endvidere kunne vi konstruere andre mutationer, som

stadig kunne binde PICK1, men dette var tilsyneladende ikke

tilstrækkeligt til at få DAT-PICK1-komplekset udtrykt på

overflademembranen. Ved progressivt at substituere med sekvens fra

den β2-adrenerge receptor, og ved at indføre trippel-alanin

substitutioner i DAT C terminalen, undersøgte vi vigtigheden af

epitoper forud for LKV-sekvensen. Substitution af aminosyrerne lige

inden LKV-sekvensen med alaniner medførte tilbageholdelse af DAT i

ER på trods af dette konstrukts evne til fortsat at kunne binde PICK1.

Dette antyder en dobbeltrolle af DAT C terminalen: En rolle i ER

eksport og overfladeudtryk, som er uafhængig af PDZ-interaktioner,

og en stadig ikke helt afklaret rolle som involverer PDZ-interaktioner

med proteiner som PICK1.

vi

Nye data foreslår en potentiel rolle for PDZ-interaktioner i

reguleringen af DAT internalisering og recycling: Vi opdagede, at

ødelæggelse af den PDZ-domænebindende sekvens påvirkede

reguleringen af DAT konstitutiv internalisering, nedbrydning og måske

også recycling i Neuro2A celler.

Vi fandt også bevis for en direkte interaktion mellem DAT og den

Ca2+/calmodulin-afhængige kinase II α (CaMKIIα), og denne

interaktion synes at afhænge af de samme epitoper, som er

essentielle for overfladeudtryk af DAT.

Endelig har vi ved hjælp af en fluorescerende kokainanalog været i

stand til at detektere dopamintransporteren på overfladen af levende

primære dopaminerge neuroner. Manglen på gode ekstracellulære

antistoffer har hidtil hæmmet forsøg på at undersøge internalisering

og recycling fænomener i levende celler, men denne nye metode

giver os et unikt værktøj for at undersøge disse mekanismer i flere

detaljer.

Alt i alt har de opnåede resultater givet ny indsigt i reguleringen af

dopamintransporteren og vil påvirke fremtidig forskning indenfor dette

område.

OriginalsprogEngelsk
UdgivelsesstedUniversity of Copenhagen
StatusUdgivet - 2005

Se relationer på Aarhus Universitet Citationsformater

ID: 11251378